長崎市の南山手の丘にある、現存する日本で最古の教会。1597（慶長元）年に殉教した日本二十六聖人に捧げられた教会で、正式には「日本二十六聖人殉教者聖堂」と言い、殉教地である西坂の丘に向かってゴシック様式の教会が立つ。
　1860（万延元）年に長崎に外国人居留地が開かれた後、居留地に住む外国人向けの教会として、パリ外国宣教会所属のプティジャン神父の指導により、1864（元治元）年に竣工し、大風で一部破損し、明治になり信徒が急増したため、フランス寺と呼ばれた教会堂を包み込み、1879（明治12）年に増築した。
　天主堂が献堂式を迎えた 1か月後、浦上に住む約15名の潜伏キリシタンが訪れ、自分たちの信仰を告白し、サンタ・マリアの御像の場所を尋ねた。日本でのキリシタン発見のニュースは世界を驚かせ、国内では宣教師の指導下に戻る潜伏キリシタンが相次いだが、いまだ禁教令が続いていた当時の日本では、浦上四番崩れや五島崩れなどの大規模な弾圧が起こった。こうした明治政府の対応は西洋諸国から強い非難を浴び、不平等条約改正交渉の妨げとなったことから、1873（明治6）年に明治政府はキリスト教を解禁、その後はカトリックに復帰した信徒たちにより、各地に教会堂が建てられていった。
　天主堂に隣接して、旧羅典神学校＊と旧長崎大司教館＊の建物がある。現在は「大浦天主堂キリシタン博物館」として、日本キリシタン史を紹介している。
教会は 1933（昭和8）年に国宝となるが原爆被害を受け、1953（昭和28）年、日本最古の教会として国宝に再度指定された。